CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入門

Kit v4 - Manual v4.0

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第一天

第一部分：CUT&RUN緩沖液的制備（約30分鐘）

1. 按下表所述配制緩沖液。

注意：應(yīng)根據(jù)完整手冊附錄1.1中的說明，根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化Digitonin（洋地黃皂苷） 的用量。

注意：以下流程皆按單個樣本計(jì)算，請根據(jù)實(shí)際樣本數(shù)量等比例配制

。

第二部分：ConA磁珠活化（約30分鐘）

2. 輕輕重懸ConA磁珠，取11 µL至1.5 mL離心管中。

3. 將離心管放在磁力架上，使溶液澄清；用移液器去除上清液。

4. 從磁力架上取下離心管。立即加入100 μL冷的Bead Activation Buffer，并用移液器將磁珠充分重懸。將離心管放回磁力架，使溶液澄清，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次。

5. 加入11 µL冷的Bead Activation Buffer重懸磁珠。

6. 按照10 µL/管的量，將磁珠等分到8聯(lián)排管中；置于冰上。

第三部分：細(xì)胞與活化磁珠結(jié)合（約30分鐘）

7. 計(jì)數(shù)起始細(xì)胞并確認(rèn)其完整性和活力。每樣本使用500,000個細(xì)胞（可多加10%）。

8. 室溫下以600×g的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，用移液器去除上清液。

9. 用100 µL的Wash Buffer重懸細(xì)胞。室溫下以600×g的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次。

10. 用105 µL的Wash Buffer重懸細(xì)胞。對制備好的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并檢查其完整性。

11. 將 100 µL 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10 µL 活化 ConA 磁珠的8聯(lián)排管中。輕輕渦旋重懸，短暫快速離心，將磁珠收集到管底部。

12. 室溫孵育10分鐘，使細(xì)胞吸附到磁珠上。

13. 如果使用多通道移液器，請將試劑槽置于冰上，注入冷的Antibody Buffer。注意：一次取出并更換一條8聯(lián)排管的緩沖液，以避免 ConA 磁珠變干和樣品丟失。

14. 將離心管放在磁力架上，使溶液澄清，用移液器去除上清液。保存10 µL上清液用于臺盼藍(lán)染色，以確定上清液中沒有細(xì)胞（可依據(jù)完整手冊附錄1.2）。

15. 從磁力架上取下離心管。立即加入50µL冷的Antibody Buffer并用移液器吹吸重懸。取 10 µL重懸樣品以確認(rèn)細(xì)胞結(jié)合到了ConA磁珠上（可依據(jù)完整手冊附錄1.2）。

第四部分：抗體結(jié)合（約30min +過夜）

16. 瞬時離心K-MetStat Panel原液并用移液器吹吸混勻（切勿渦旋）。在指-定用于H3K4me3和IgG對照抗體的反應(yīng)中，加入2 µL K-MetStat Panel并渦旋混勻。注意：如果使用的細(xì)胞數(shù)少于500000個，請按照完整手冊第16頁的說明減少K-MetStat Panel的量。

17. 每個樣品加入0.5 µg抗體。對于指-定的對照反應(yīng)，加入1µL IgG或H3K4me3對照抗體。輕輕渦旋混勻。

18. 在4oC條件下，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀（nutator）上孵育過夜，管蓋稍稍抬高。切勿翻轉(zhuǎn)離心管。

第二天

第五部分：pAG-MNase結(jié)合（約40 min）

19. 將試劑槽放在冰上，注入冷的Cell Perm. Buffer。

20. 將離心管從4℃條件下取出，瞬時離心收集液體。注意：磁珠過夜可能沉淀，屬正?，F(xiàn)象。

21. 將離心管置于磁力架上，使溶液澄清，去除上清液。

22. 將離心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次。

23. 從磁力架上取下離心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer，輕輕渦旋混勻。注意：磁珠在這個階段可能會結(jié)塊，可用移液器輕柔吹吸，使結(jié)塊分散。

24. 每管加入2.5µL pAG-MNase。輕輕旋渦或用移液器吹吸，以重懸磁珠并使酶均勻分布。

25. 室溫孵育10分鐘。

26. 瞬時離心后，置于磁力架上，使溶液澄清，去除上清液。

27. 將離心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次。

28. 從磁力架上取下離心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer。用移液器輕輕吹吸混勻、分散團(tuán)塊。

第六部分：目標(biāo)染色質(zhì)片段化（約3小時）

29. 將離心管置于冰上。每管加入1 μL 100 mM的氯化鈣，輕輕渦旋或用移液器吹吸均勻。

30. 將離心管（管蓋略微抬高）放在旋轉(zhuǎn)混勻儀上4oC孵育 2 小時。

31. 制備終止液：取1µL E. coli Spike-in DNA與33µL Stop Buffer混合（單個反應(yīng)用量）。輕輕旋渦混勻。注意：如果使用的細(xì)胞數(shù)少于500,000個，請按照完整手冊附錄2中的說明稀釋E. coli Spike-in DNA。

32. 孵育結(jié)束后，向每個反應(yīng)中加入34 μL終止液，輕輕旋渦混勻。

33. 將反應(yīng)離心管置于37℃熱循環(huán)儀中，孵育10分鐘。

34. 瞬時離心后，置于磁力架上，使溶液澄清。將含有DNA富集產(chǎn)物的上清液轉(zhuǎn)移到新的8聯(lián)排管中。丟棄含有ConA磁珠的離心管。

第七部分：DNA純化（約30分鐘）

35. 用無水乙醇（EtOH）和分子生物學(xué)級別的水制備85%乙醇（EtOH）（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

36. 重懸SPRIselect試劑（Beckman Coulter, Inc），向每個反應(yīng)管中緩慢加入119 µL。

37. 輕輕旋渦混勻，瞬時離心以收集液體。室溫孵育5分鐘。

38. 將離心管放在磁力架上2-5分鐘。用移液器去除上清液，不要用移液管吸頭攪動磁珠。

39. 將離心管保留在磁力架上。每管加入 180 µL 85% EtOH，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次。

40. 瞬時離心，管蓋朝內(nèi)，使磁珠留在離心管一側(cè)。將離心管放回磁力架上，去除殘留的EtOH。

41. 從磁力架上取下離心管，打開管蓋。室溫風(fēng)干磁珠2-3分鐘或直到液體蒸發(fā)，但磁珠仍然呈現(xiàn)潮濕的啞光棕色。如果磁珠有裂紋或呈淺棕色，說明過于干燥。

42. 每管加入17 µL 0.1X TE buffer洗脫DNA。

43. 渦旋重懸磁珠，室溫孵育2分鐘。

44. 將離心管置于磁力架上2分鐘。將15µL CUT&RUN DNA轉(zhuǎn)移到新的8聯(lián)排管中。

45. 使用Qubit熒光儀對1 μL DNA進(jìn)行濃度測定。繼續(xù)文庫制備或?qū)NA保存在-20oC。

關(guān)于預(yù)期結(jié)果，可參閱完整手冊。切勿使用TapeStation/Bioanalyzer檢測 CUT&RUN DNA。DNA的產(chǎn)量太低，無法在這些平臺上進(jìn)行檢測，而且在實(shí)驗(yàn)步驟的這一步也無法提供有用的信息。可等到文庫制備后再檢查片段分布。

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